«Богат и славен Кочубей, / Его луга необозримы», он владеет многими сокровищами, но главное богатство Кочубея — его дочь Мария, равной которой нет во всей Полтаве. Не одной красотой славится Мария, но всем известен ее кроткий нрав. Множество женихов сватается к ней, но сердце Марии неприступно. И вот сам гетман Мазепа шлёт за ней сватов. Гетман уже стар, но в нем кипят чувства, не переменчивые чувства молодости, а ровный жар, который не остывает до самой смерти.
Родители Марии в негодовании, они возмущены поведением старца, ведь Мария — крестница гетмана. Мать Марии говорит, что Мазепа нечестивец, что о замужестве не может быть и речи. Слыша это все, Мария падает без чувств. Два дня Мария не может прийти в себя, а на третий день исчезает. Никто не заметил, как она скрылась, лишь один рыбак слышал ночью конский топот, а утром «след осьми подков / Был виден на росе лугов».Скоро до Кочубея дошла страшная весть о том, что его дочь бежала к Мазепе. Лишь сейчас поняли старики причину душевного смятения своей дочери. И Кочубей замыслил план мести гетману.
«Была та смутная пора, / Когда Россия молодая, / В бореньях силы напрягая, / Мужала с гением Петра». В борьбе со шведским королём Карлом XII Русь окрепла. Украина волновалась, много находилось сторонников древней вольности, которые требовали от гетмана, чтобы он разорвал договор с Россией и сделался союзником Карла, но Мазепа «молве, казалось, не внимал» и «оставался / Послушным подданным Петра».
Молодёжь роптала на гетмана, мечтая, объединившись с Карлом, «грянуть <…> войною / На ненавистную Москву!». Но никто не ведал тайных планов коварного и мстительного Мазепы. Давно он вынашивает план измены, никому не открывая его, но тайные его помыслы постиг оскорблённый Кочубей и задумал отомстить за оскорбление дома, открыв Петру планы изменника. Когда-то Кочубей с Мазепой были друзьями и поверяли друг другу свои чувства, тогда приоткрывал свои замыслы Мазепа, но теперь между ними обида, которую простить не может Кочубей. Дух мести поддерживает в нем и жена. Теперь нужен только надёжный человек, готовый, не робея, положить к ногам Петра донос Кочубея на гетмана.
Такой человек нашёлся среди полтавских казаков, когда-то отвергнутый Марией, но по-прежнему любящий ее даже в ее позоре и ненавидящий ее соблазнителя. Он отправляется в путь с зашитым в шапке доносом Кочубея на изменника-гетмана. Мазепа же, не подозревающий о страшной опасности, плетёт политическую интригу, ведя переговоры с посланником иезуитов, возмущая казаков на Дону, поднимая против Москвы Крым, Польшу и Турцию. И вот посреди этих коварных забот русские вельможи переслали ему донос на него, писанный в Полтаве и оставленный Петром без внимания. Оправдываясь перед Петром и убеждая его в своей верности, Мазепа требует казни доносчиков, казни отца своей возлюбленной, «...но дочери любовь главы отцовской не искупит». Мария же самозабвенно любит Мазепу и презирает молву. Лишь иногда ею овладевает печаль при мысли о родителях. Но она не знает ещё того, что знает уже вся Украина, страшная тайна от неё скрыта.
Мазепа мрачен, и «ум его / Смущён жестокими мечтами». Даже ласки Марии не в состоянии развеять его страшные мысли, он остаётся холоден к ним. Оскорблённая Мария укоряет его, говоря, что ради него сгубила собственное счастье, опозорила себя. Мазепа пытается успокоить Марию словами любви, но она обвиняет его в хитрости и притворстве. Она даже ревнует его к некой Дульской. Мария хочет знать причину Мазепиной холодности. И Мазепа открывает ей свои замыслы восстания Украины против владычества Москвы. Мария в восторге и жаждет видеть возлюбленного с царским венцом на голове. Она сохранит ему верность и в несчастье и даже пойдёт с ним на плаху. И Мазепа подвергает Марию страшному испытанию: он спрашивает, кто ей дороже — отец или супруг? Он старается принудить ее к однозначному ответу, ставит ее перед ужасным выбором: чью гибель она предпочтёт, если ей будет суждено выбирать, кого отправить на казнь. И желанный ответ получен.
«Тиха украинская ночь». В старом замке в Белой Церкви сидит в башне окованный Кочубей и ждёт казни, которой не боится — его гнетёт позор, потеря чести. Он отдан царём на поругание врагу, не имея возможности никому завещать свою месть обидчику. Открывается дверь его темницы, и входит кровожадный Орлик. Мазепе известно, что Кочубей спрятал сокровища, и Орлик пришёл узнать, где они таятся. Кочубей отвечает, что его сокровищами были его честь, честь дочери, но эти сокровища отняты пыткой и Мазепой, а третий клад — святую месть — он готовится снести Богу, Орлик допытывается, где спрятаны деньги, но безуспешно, и Кочубея отдают в руки палачу.
Мария, ласкаемая Мазепой, ещё не знает об ужасной судьбе отца, и Мазепа содрогается от мысли, что будет с ней, когда все откроется. Он раскаивается, что прельстил ее, что попытался впрячь в одну телегу «коня и трепетную лань». Оставя сидящую в неведенье Марию, мучимый сомнениями, Мазепа выходит из дворца.