1. Получение исходного генетического материала – гена , кодирующего интересующий белок( признак)
· Необходимый ген может быть получен двумя способами : искусственный синтез или выделение природных генов
· Искусствееный синтез генов вне организма возможен двумя способами :
q Ферментативный синтез - « вырезание » необходимого гена из донорской ДНК клеток интересующего организма с помощью специальных ферментов – рестиктаз
v Рестриктазы – ферменты , относящийся к классу гидролитических ферментов ( гидролаз ) , а именно к группе нуклеаз или эндонуклеаз – ферментам гидролизующим связи нуклеиновых кислот ( ДНК и РНК ) внутри полимерной цепи по строго определённым последовательностям нуклеотидов ; в настоящее время известно около 500 рестриктаз , специфичных к определённым триплетам
v Каждая рестриктаза режет молекулу ДНК только в том месте , где находится определённый триплет , который она может узнавать из множества других ; в результате двойная нить ДНК разделяется на участки ( гены )
v При разделениии ДНК образуются её фрагменты ( гены ) , имеющие однонитевые , так называемые « липкие концы » , имеющие комплементарные основания , которые в присутствии другого фермента могут соединяться ( слипаться ) с комплементарными им « липкими » концами другой ДНК , предварительно разрезанной рестриктазами
v Рестриктаза узнаёт свой триплет в молекуле ДНК любого происхождения – будь то одноклеточные организмы , растения , животные или человек , поэтому образованные липкие концы у молекул ДНК ( генов ) разного происхождения будут оканчиваться на одинаковые триплеты и способны комплементарно соединятся
q Химический
а ) искусственный синтез гена in vitro из отдельных нуклеотидов ( впервые синтезирован индийцем Г. Кораной в 1970 году )
б ) копирование соответствующих матриц РНК ( при этом используется фермент обратная транскриптаза , катализирующий реакции синтеза ДНК на м-РНК )
v Из клеток выделяют и-РНК , являющуюся транскрипционной копией нужного гена , и с помощью фермента – обратной транскриптазы синтезируют комплементарную ей цепь ДНК ; затем и-РНК , спаренную с цепью ДНК , уничтожается специальным ферментом , а оставшаяся цепь ДНК служит матрицей для синтеза комплементарной второй цепи ДНК ; получившаяся двойная спираль ДНК называется к-ДНК ( комплементарная ДНК ) и является искомым геном ( к-ДНК не имеет интронов как все бактериальные гены )
v Искусственно синтезированы гены глобина человека , кролика , голубя , гены синтеза человеческого инсулина и сомато статина , гены митохондрии печени крыс и др.